用Trizol 的溶液提取,将总RNA与 DNA 和蛋白质分离。Trizol 是一种酸性溶液,含有硫氰酸胍 (GITC)、苯酚和氯仿。
提取步骤
组织:每 100 毫克新鲜组织加入 1 毫升 TRIzol 试剂,使用无菌手术刀在冰上切碎,并用无菌匀浆器或其他设备匀浆。
细胞:如果是细胞培养物,应在从培养箱中取出后立即进行处理。细胞在室温(15-25 ºC)下以 1000rpm 离心5 分钟,然后丢弃上清液或从单层生长的细胞中去除培养基,用预冷PBS洗一次。每 1 × 10<7> 细胞加入 1 ml TRIzol 试剂。
1. 4°C 预冷离心机
2. 将组织或细胞裂解液转移到 1.5毫升无RNA酶EP管中。置冰上,静置 5 分钟。
3. 每管加入200ul氯仿,充分混合后冰上静置10分钟,使核蛋白复合物完全解离。
4. 在 4°C 下以 13000 rpm离心 15 分钟。期间,取一新EP管,加入500ul异丙醇,冰上预冷。
5. 离心后,将上层水相 (约500 ul) 转移到该新的 EP管中。
6. 冰上静置,酒精沉淀10min。
7. 离心, 13000 rpm, 10 分钟。
8. 去除上清液。用 1ml 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀一次。
9. 12000rpm离心 5 分钟。
10. 去掉上清,风干或真空干燥 RNA 沉淀 5-10 分钟。
11. 将 RNA 溶解在30-50ul DEPC 处理过的去离子水中(需根据RNA沉淀的量加水溶解)。
12. 进行分光光度分析以确定样品浓度和纯度。